U poslednje vreme, preko medija, sve češće čujemo kako se govori i raspravlja o pozitivnom/negativnom PCR testu. Na kojim principima se zasniva njegov rad i dokle sežu granice njegove primene?
PCR (Polymerase Chain Reaction) predstavlja lančanu reakciju umnožavanja određenog segmenta DNK simulirajući proces replikacije koji se normalno odvija u ćeliji i pri kome se od jednog molekula DNK dobijaju dva identična.
Koje su komponente neophodne za odvijanje reakcije?
– DNK – uzorak koji se ispituje,
– Nukleotidi – gradivni blokovi koji su neophodni za sintezu novih lanaca,
– Prajmeri – oligonukleotidni (kratki po broju) lanci koji predstavljaju karakterističnu komplementarnu sekvencu nukleotida koja označava početak odnosno kraj segmenta koji želimo da umnožimo,
– Taq polimeraza – enzim odgovoran za sintezu novih lanaca.
Joni metala služe da optimizuju reakciju, a isto važi i za variranje temperature tokom ciklusa.
Ciklus se sastoji iz tri faze:
1. Denaturacije, u kojoj dolazi do razdvajanja lanaca DNK usled zagrevanja. Inicijalna denaturacija traje od 3 do 5 minuta, a naredne po pola minuta;
2. Hibridizacije, tj. spajanja prajmera s ciljnim segmentom, što traje do jednog minuta;
3. Polimerizacije, u kojoj Taq polimeraza pronalazi prajmere i započinje ugradnju nukleotida. Trajanje ove faze može varirati od 20 sekundi do 2 minuta u zavisnosti od dužine segmenta koji želimo da umnožimo.
Kao što se vidi na slici, broj kopija segmenta DNK od interesa umnožava se
geometrijskom progresijom; to i jeste cilj metode: umnožiti segment od interesa, kako bi postao dominantan u uzorku. Da bismo stekli uvid u moć umnožavanja uočimo da:
– pre početka izvođenja metode postoji samo jedna kopija DNK,
– nakon prvog ciklusa postoje 2 kopije,
– nakon drugog – 4,
– nakon trećeg – 8,
– nakon desetog – 1 024,
– nakon dvadesetog – 1 048 576,
– a nakon trideset petog – 34 359 738 368 kopija.
Najčešće se izvodi između dvadeset pet i trideset pet ciklusa; trajanje izvođenja PCR analize možemo aproksimirati na vremenski interval od 60 do 90 minuta (iz ove računice izuzeto je trajanje predtretiranja uzorka, specifične modifikacije i dodatni koraci unutar same metode, kao i administrativne procedure tokom obrade uzoraka).
Ukoliko govorimo o testu na Covid-19, stvar je malo drugačija: prvo se od virusne RNK pomoću enzima reverzne-transkriptaze dobija komplementarna DNK; ona se tokom ciklusa umnožava pomoću prajmera obeleženih fluorescentnom bojom, čije svetlucanje detektuje
aparat. Ukoliko je test pozitivan, kako se ciklusi smenjuju jedan za drugim, javlja se nagli porast svetlucanja (kao na slici), dok kod negativnih testova taj porast ne postoji.
Primer rezultata pozitivnog PCR testa (izvor: Business Insider)
Primene PCR metode, izuzev u svojstvu testa na Covid-19, sreću se najčešće u molekularnoj
biologiji i naučno-istraživačkom radu, u forenzici i u dijagnostici (genska testiranja i
prenatalna dijagnostika).